Studies on the stabilization of RNA structures through metal ions, ion-π interactions and metallo-supramolecular helicates

Abstract

Teil I Supramolekulare zweikernige Eisen(II)-Komplexe [Fe 2 L3 ]4+ sind helikale Zylinder die dank ihren ausserordentlichen DNS Bindungseigenschaften potentielle Antikrebsmittel sind. Die Zylinder können einerseits spezifisch an Y-förmige dreiarmige DNS Kreuzungen binden. Es wurde aber auch eine Anlagerung an die grosse Furche doppelsträngiger DNS gezeigt. Die geeignete Grösse und Form der Helikate sowie ihre hohe elektrostatische Ladung sind verantwortlich für diese nichtkovalenten Wechselwirkungen. Behandlung von Krebszelllinien mit den zylinderförmigen Komplexen resultierten in erhöhten Zellsterblichkeitsraten ohne das Erbgut der Zellen zu schädigen. Dieser alternative Mechanismus des Eisen(II) Supramoleküls könnte ein vielversprechender Schritt in Richtung Behandlung von Krebs sein, welcher schon Resitenzen gegen andere Chemotherapeutika aufweist. Die nichtkovalente Art der Erkennung von dreiarmigen Kreuzungen könnte somit die Entwicklung neuartiger Medikamente ermöglichen. RNS erfüllt verschiedene regulatorische Funktionen in einer Zelle. Da DNS und RNS eine sehr ähnliche Struktur aufweisen, stellte sich die Frage ob der Zylinder auch an RNS binden würde. RNS kommt meist als einzelsträngiges Molekül vor welches ein hohes natürliches Vorkommen an dreiarmigen Kreuzungen als potentielle Zielbindungsstellen enthält Die Beeinflussung der RNS in lebenden Zellen könnte ein Schlüsselelement in der Antitumoraktivität des Zylinders sein. In der ersten Studie dieser Dissertation wurden deshalb verschiedene RNS Konstrukte künstlichem oder natürlichem Ursprungs als Ziel für die Eisen(II) Zylinder verwendet. Das RNS Analogon der kürzlich entdeckten dreiarmigen DNS Kreuzung konnten erfolgreich kristallisiert und die Struktur mittels Röntgenkristallografie charakterisiert werden. Ferner wurden zwei weitere Kristallstrukturen der dreiarmigen RNS Kreuzung mit Kobalt(II) und Nickel(II) Zylindern gelöst. Diese drei Kristallstrukturen haben eine identische Topologie. Der Metallzylinder befindet sich im Zentrum der dreiarmigen RNS Kreuzung. Die inneren Ringe der aromatischen Liganden des Zylinders sind in π-Stapelwechselwirkung mit den zentralen Basenpaaren der RNS, die als drei Doppelhelices vom Inneren der dreiarmigen Kreuzung wegführt. Ein Vergleich der bekannten Kristallstruktur der dreiarmige DNS Kreuzung mit der dreiarmige RNS Kreuzung zeigt einen strukturellen Unteschied: Die enge Öffnung an der einen Seite der dreiarmigen DNS Kreuzung beschränkt die innere Platzierung des Zylinders auf eine gewisse Tiefe. Der Zylinder kann aber mit der dreiarmigen RNS Kreuzung eine maximale π-Stapeloberfläche einnehmen: beide Öffnungen der Kreuzung sind weit genug für eine freie Beweglichkeit des Zylinders und ermöglichen somit eine energetisch optimale Geometrie. Dies ist die erste Charakterisierung einer induzierten dreiarmigen RNS Kreuzung, die spezifisch durch einen supramolekularen Zylinder erkannt wurde. Teil II Tertiärstrukturen grosser Polyanionen wie DNS oder gerade RNS (z.B. Ribozyme) schliessen eine hochkomplexe dreidimensionale Architektur ein, die Haarnadelstrukturen, Schlaufen und viele andere lokale Strukturen beinhalten. Zur Ladungskompensation und um den Nukleinsäuren eine Faltung in die native Struktur zu ermöglichen, sind mono- und divalente Metallionen wie Na+, K+, Mg2+, or Ca2+ eine Grundvoraussetzung. Spezifisch gebundene Metallionen koordinieren dabei mit hoher Selektivität an die Phosphatsauerstoffatome sowie an die verschiedenen funktionellen Gruppen der Nukleosidreste, wie Carbonylgruppen, Ringstickstoffe oder Hydroxylgruppen. Nebst innersphere (direkt gebunden) Interaktionen ist ein weitreichendes Netzwerk an Wasserstoffbrücken durch outersphere (via ein Ligandatom) Koordination entscheidend um eine starke Bindung zu erreichen. Um den Ursprung dieser Selektivität aufzuklären erstellten wir eine neue Datenbank: MINAS - Metal Ions in Nucleic AcidS (Metallionen in Nukleinsäurestrukturen) beinhaltet die exakten geometrischen Informationen über Liganden der ersten (innersphere) und zweiten (outersphere) Koordinationssphäre jedes Metallions in Nukleinsäurestrukturen, die in der PDB abgelegt sind. Das Einschliessen der zweiten Koordinationssphäre in der MINAS Datenbank erlaubt somit ein erstes Mal auch den Effekt weiter entfernter Liganden auf die Metallionenbindung zu beurteilen: Dies ist zum Beispiel wichtig, da in RNS Metallionen Katalyse über Distanzen von bis zu 20 Å beeinflussen können. Zusätzlich ermöglichen die Informationen über Nukletoide, die sich in der Nähe der Bindungstaschen befinden, eine detailierte Suche aller potentieller Ligandenkombinationen und aller möglichen Koordinationsbereiche von Metallionen. MINAS ist deshalb ein ideales neues Instrument um Metallionenbindungstaschen in Nukleinsäuren statistisch zu klassifizieren, allgemeine Schlussfolgerung über die verschiedenen Koordinationseigenschaften dieser Ionen zu ziehen und verschiedene Bindungsarten von Metallionen in Nukleinsäuren zu vergleichen. Die zweite Studie dieser Dissertation beinhaltet die Erstellung der MINAS Datenbank sowie die Auswertung der Bindungsstellen von nahezu 100'000 Metallionen verschiedener Nukleinsäurestrukturen. Diese globale Strukturenanalyse zeigt die bevorzugten Bindungsstellen für verschiedene Metallionen. Die Daten zeigen erwartete Präferenzen für Liganden, die sich für Alkali-, Erdalkali- und Übergangsmetalle unterscheiden. Das anionische Phosphatrückgrat ist die häufigste Bindungsstelle für Metalle in Nukleinsäuren, besonders für Mg2+, dem häufigsten Metallion in der MINAS Datenbank mit über 70'000 Einträgen. Bis zu vier gleichzeitige Koordinationen zu Phosphatsauerstoffatomen wurden gefunden. Des Weiteren zeichnet sich die Hoogsteen Seite von Guanin als die häufigste ungeladene Bindungsstelle aus. Ihre Wasserstoffbrücken-Donor-Eigenschaft macht N7 und O6 zu perfekten Liganden für Metallionenkoordination. In der letzten Studie dieser Dissertation wurden Kationen-π und Anionen-π Wechselwirkungen innerhalb von Nukleinsäuren untersucht. Diese nichtkovalenten molekularen Wechselwirkungen wurden z.B in kleinen aromatischen Molekülen, die mit Metallionen interagieren, sowie in der Anordnung von Kristallstrukturen beobachtet. Im biomolekularen Kontext spielen Ionen-π Bindungen eine wichtige Rolle indem sie den Transport von Metallionen durch Ionenkanäle ermöglichen oder zu einer erfolgreichen Ligand-Rezeptorerkennung beitragen. Erkennung von Nukleinsäuren durch geladene Seitenketten von Proteinen kann ebenfalls durch Kationen-π Wechselwirkungen stattfinden. Um das Ausmass der Kationen-π und Anionen-π Wechselwirkungen in DNS-und RNS-Systemen zu untersuchen, wurde eine Suche durch alle Nukleinsäurestrukturen die in der PDB abgelegt sind durchgeführt. Die automatisierte Analyse von tausenden von Nukleobasen zeigte, dass von allen negativ geladenen Spezies, die häufigste Anionen-π Wechselwirkung durch eine intramolekulare Interaktion von Phosphatsauerstoffatomen mit den π-Systemen von Nukleobasen auftritt. Kationen-π Interaktionen werden ebenfalls durch verschiedene Spezies eingegangen, einschliesslich einiger Metallionen. Den grössten Teil der Kationen-π Wechselwirkungen macht Arginin aus, dessen positiv geladene Seitenkette mit den Nukleobasen interagieren kann, wenn ein Protein an DNS oder an RNS bindet.