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Neuroprotection by hypoxic preconditioning : the role of HIF-1α


Thiersch, Markus. Neuroprotection by hypoxic preconditioning : the role of HIF-1α. 2009, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

SUMMARY Background: Blinding diseases like retinitis pigmentosa (RP) or age-related macular degeneration (AMD) share a common feature – the loss of vision due to photoreceptor cell death. To mimic the pathogenesis of retinal degeneration, we employ a model of light-induced retinal degeneration, where photoreceptors undergo apoptosis after extensive exposure to white fluorescent light. Among several neuroprotective strategies to inhibit or delay neuronal degeneration, hypoxic preconditioning has been shown to successfully prevent photoreceptor cell death. The molecular mechanisms, which are required for retinal cell survival, are largely unknown. However, hypoxia activates various transcription factors, which differentially regulate the expression level of potential neuroprotective genes. Among those transcription factors, hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) responds very specifically to low oxygen levels and alters the gene expression pattern during hypoxia. HIF-1 is a heterodimeric transcription factor, consisting of the constitutively expressed subunit HIF-1β and the oxygen dependent regulated subunit HIF-1α. Upon oxygen deprivation HIF-1α is stabilized, dimerizes with HIF-1β and regulates the expression of genes involved in different pathways like metabolism, angiogenesis or cell survival. Although studies show a correlation of HIF-1α induction and neuroprotection, the role of HIF-1α in retinal neuroprotection after hypoxic preconditioning remains unknown. Here, we analyzed the function of retinal HIF-1α stabilization during hypoxic preconditioning and its impact on neuroprotection in a model of light induced retinal degeneration. Additionally, we investigated the change of retinal gene expression pattern due to hypoxic preconditioning to identify possible neuroprotective target genes. Results: To analyze differential gene expression after hypoxic exposure, we isolated retinas of mice immediately, 2 hours, 4 hours and 16 hours after hypoxia and compared their retinal transcriptome to their corresponding normoxic controls by using micro-arrays. Upon hypoxia, we observed a rapid alteration in the retinal transcriptome, which was restored within 16 hours of reoxygenation. A strong induction of cyclin-dependent kinase inhibitor 1a, with a potential role in cell survival, was observed. We challenged hypoxic preconditioned p21 knock out mice with toxic levels of white light and showed that p21 expression is not essential to protect the retina against light-induced retinal degeneration. Selective clustering of differentially regulated genes suggested additional potential neuroprotective candidate genes like metallothionein1/2, Cebpd or adrenomedullin. Further, we used conditional HIF-1α knock out mice to elucidate the role of this transcription factor in retinal neuroprotection after hypoxia. The specific deletion of HIF-1α in photoreceptor cells led to a significant reduction of HIF-1α mRNA and protein levels. Accordingly, HIF-1 target gene expression after hypoxia was significantly diminished. Surprisingly, the strong neuroprotective effect of hypoxic preconditioning persisted in conditional knock out mice showing that HIF-1α is not required to protect photoreceptor cells in an autocrine fashion. Additionally, HIF-1α was not required to endure hypoxic preconditioning per se. Induction of HIF-2α and pSTAT3 in wild type and in knock out mice suggests that these factors might compensate for the lack of HIF-1α and confer photoreceptor resistance to light damage after hypoxic preconditioning. Furthermore, several potentially neuroprotective genes, detected during micro-array analyses of the hypoxic retinal transcriptome, were similarly induced in knock out and control mice after hypoxia. Conclusion: The mechanisms of retinal neuroprotection due to hypoxic preconditioning are largely unknown. The discovery of pathways, transcription factors or specific genes which are required to facilitate retinal neuroprotection should help to understand molecular changes in retinal pathology. Controlling the expression of identified neuroprotective genes or upstream transcription factors, which govern death or survival pathways, provides a possibility to precisely design prospective therapeutic approaches. This study presents an overview of genes, which are differentially regulated in the retina after hypoxia and suggests potential target genes for further investigation. Additionally, we analyzed the role of HIF-1α and it’s involvement in retinal neuroprotection by hypoxic preconditioning. We showed that the photoreceptor cell-specific stabilization of HIF-1α during hypoxic preconditioning is not required to protect these cells against toxic light exposure. Therefore, we discuss the potential role of further transcription factors like HIF-2α and STAT3. ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund: Alters-abhängige Makula Degeneration (AMD) und Retinitis Pigmentosa (RP) sind Netzhauterkrankungen, die durch den Verlust von Photorezeptorzellen zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens bzw. zur vollständigen Blindheit führen. Um die pathologischen Veränderungen in der erkrankten Netzhaut zu simulieren, verwenden wir ein etabliertes Maus-Modell in dem der Zelltod von Photorezeptoren durch Licht induziert wird. Neuroprotektion ist eine Strategie, um die Degeneration von Neuronen zu verzögern oder vollständig zu inhibieren. Dabei hat sich gezeigt, dass hypoxisches Präkonditionieren – also eine zeitlich begrenzte artifizielle Reduktion der Sauerstoff- verfügbarkeit – besonders erfolgreich ist. Die Mechanismen, die zu einer Schutzreaktion in der Netzhaut führen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Allerdings weiss man, dass während der Hypoxie eine Reihe von Transkriptionsfaktoren aktiviert wird die potentielle neuroprotektive Gene differentiell regulieren. Ein solcher Transkriptionsfaktor ist hypoxic-inducible factor 1 (HIF-1), der sehr spezifisch durch einen geringen Sauerstoffgehalt aktiviert wird und die Expression mehrer Gene reguliert. HIF-1 ist ein Heterodimer, dass aus einer kontinuierlich exprimierten HIF-1β Untereinheit und einer Sauerstoff-abhängig regulierten HIF-1α Untereinheit besteht. Bei geringen Sauerstoffkonzentrationen wird die HIF-1α Untereinheit stabilisiert, dimerisiert mit HIF-1β und reguliert die Expression von Genen mit unterschiedlichen zell-biologischen Funktionen, wie z.B. Energiemetabolismus, Entwicklung von Blutgefässen oder die Induktion von Zellprotektion. Einige Studien haben Hinweise geliefert, dass HIF-1α die treibende Kraft der Netzhautprotektion nach hypoxischen Präkonditionieren sein könnte. Jedoch ist ein HIF-1α abhängiger Schutzmechanismus in der Netzhaut noch nicht vollständig bewiesen worden. Daher haben wir untersucht, ob eine Photorezeptor-spezifische Stabiliserung von HIF-1α während der Hypoxie benötigt wird, um die Netzhaut vor einer Licht-induzierten Degeneration zu schützen. Ausserdem, haben wir mit Hilfe von Micro-arrays die globale Genexpression in der Netzhaut nach hypoxischen Präkonditionieren untersucht, um mögliche neuroprotektive Kandidatengene zu indentifizieren.

Ergebnisse: Um die globale Genexpression in der Netzhaut nach hypoxischen Präkonditionieren zu analysieren, haben wir Mäuse einer reduzierten Sauerstoffkonzentration ausgesetzt. Anschliessend haben wir Netzhäute direkt oder 2 Stunden, 4 Stunden und 16 Stunden nach Hypoxie isoliert und die Genexpression mit unbehandelten Kontrolltieren verglichen. Dabei haben wir festgestellt, dass es während der Hypoxie zu einer starken Veränderung der Genexpression in der Netzhaut kommt, die sich jedoch innerhalb von 16 Stunden wieder normalisiert. Die Genexpression von Cyclin-dependent kinase inhibitor 1a (p21), welcher möglicherweise protektive Eigenschaften besitzt, war direkt nach der Hypoxie stark induziert. Um zu überprüfen ob p21 tatsächlich eine Rolle bei der Netzhautprotektion spielen könnte, haben wir hypoxisch präkonditionierte p21 “knock out” Mäuse gegen Licht exponiert. Dabei haben wir festgestellt, dass der Hypoxie-induzierte Schutz der Netzhaut unabhängig von einer p21 Expression funktionieren kann. Durch die funktionelle Gruppierung von differentiell regulierten Genen konnten wir weitere mögliche Kandidaten wie Metallothionein 1/2, Cebpd oder Adrenomedullin identifizieren. Um festzustellen, ob HIF-1α tatsächlich essentiell für die Protektion der Netzhaut ist, haben wir Mäuse mit einem Photorezeptor-spezifischen HIF-1α knock out analysiert. Funktionell führte das sowohl zu einer reduzierten HIF-1α Genexpression in der Retina als auch zu einer reduzierten Proteinakkumulation der HIF-1α Untereinheit unter hypoxischen Bedingungen. Dementsprechend waren nach der Hypoxie auch Gene, die durch HIF-1 reguliert werden, weniger stark induziert. Nachdem wir hypoxisch präkonditionierte HIF-1α knock out Mäuse mit hohen Lichtintensitäten gestresst haben, zeigte sich, dass eine HIF-1α Stabilisierung in Photorezeptoren nicht zwingend notwendig ist, um eine Neuroprotektion zu gewährleisten. Ausserdem war eine Photorezeptor-spezifische HIF-1α Expression nicht erforderlich, um die Netzhaut vor transienter Hypoxie per se zu schützen. Die Induktion von HIF-2α und pSTAT3 in knock out und Kontrollmäusen könnte ein Hinweis darauf sein, dass diese Faktoren den Verlust von HIF-1α kompensieren können und somit die Netzhaut weiterhin gegen Lichtschaden schützen. Zusätzlich haben wir beobachtet, dass potentiell neuroprotektive Gene in HIF-1α knock out Mäusen und in Kontrollmäusen vergleichbar exprimiert wurden. Signifikanz: Die grundlegeneden Mechanismen, welche die Netzhaut durch hypoxisches Präkonditionieren schützen, sind nicht komplett aufgeklärt. Die Identifizerung von Signalwegen, von Transkriptionsfaktoren oder von spezifischen Genen, die für einen Schutz der Netzhaut essentiell sind, könnte ebenfalls Aufschluss über grundlegende pathologische Veränderungen in Modellen für Netzhauterkrankungen geben. Die Kontrolle der Expression von identifizierten Genen bzw. die Kontrolle von Transkriptionsfaktoren mit nachgewiesenen Schutzeigenschaften bietet die Möglichkeit einer therapeutischen Strategie, um Netzhauterkrankung einzuschränken oder zu verhindern. In unserer Studie geben wir einerseits einen generellen Überblick über Gene die durch hypoxisches Präkonditionieren differentiell reguliert werden und haben andererseits spezifische Kandidaten-Gene mit potentiell neuroprotektiven Eigenschaften identifiziert. Nachdem wir mit p21 bereits einen ersten Kandidaten selbst analysiert haben, stellt diese Studie weitere Proteine oder Gene zur detaillierten Analyse zur Verfügung. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Photorezeptor-spezifische Expression von HIF-1α nicht zwingend notwendig ist, um Photorezeptoren gegen toxische Lichtintensitäten zuschützen. In diesem Zusammenhang diskutieren wir die mögliche Beteiligung von anderen Transkriptionsfaktoren wie HIF-2α und pSTAT3.

Abstract

SUMMARY Background: Blinding diseases like retinitis pigmentosa (RP) or age-related macular degeneration (AMD) share a common feature – the loss of vision due to photoreceptor cell death. To mimic the pathogenesis of retinal degeneration, we employ a model of light-induced retinal degeneration, where photoreceptors undergo apoptosis after extensive exposure to white fluorescent light. Among several neuroprotective strategies to inhibit or delay neuronal degeneration, hypoxic preconditioning has been shown to successfully prevent photoreceptor cell death. The molecular mechanisms, which are required for retinal cell survival, are largely unknown. However, hypoxia activates various transcription factors, which differentially regulate the expression level of potential neuroprotective genes. Among those transcription factors, hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) responds very specifically to low oxygen levels and alters the gene expression pattern during hypoxia. HIF-1 is a heterodimeric transcription factor, consisting of the constitutively expressed subunit HIF-1β and the oxygen dependent regulated subunit HIF-1α. Upon oxygen deprivation HIF-1α is stabilized, dimerizes with HIF-1β and regulates the expression of genes involved in different pathways like metabolism, angiogenesis or cell survival. Although studies show a correlation of HIF-1α induction and neuroprotection, the role of HIF-1α in retinal neuroprotection after hypoxic preconditioning remains unknown. Here, we analyzed the function of retinal HIF-1α stabilization during hypoxic preconditioning and its impact on neuroprotection in a model of light induced retinal degeneration. Additionally, we investigated the change of retinal gene expression pattern due to hypoxic preconditioning to identify possible neuroprotective target genes. Results: To analyze differential gene expression after hypoxic exposure, we isolated retinas of mice immediately, 2 hours, 4 hours and 16 hours after hypoxia and compared their retinal transcriptome to their corresponding normoxic controls by using micro-arrays. Upon hypoxia, we observed a rapid alteration in the retinal transcriptome, which was restored within 16 hours of reoxygenation. A strong induction of cyclin-dependent kinase inhibitor 1a, with a potential role in cell survival, was observed. We challenged hypoxic preconditioned p21 knock out mice with toxic levels of white light and showed that p21 expression is not essential to protect the retina against light-induced retinal degeneration. Selective clustering of differentially regulated genes suggested additional potential neuroprotective candidate genes like metallothionein1/2, Cebpd or adrenomedullin. Further, we used conditional HIF-1α knock out mice to elucidate the role of this transcription factor in retinal neuroprotection after hypoxia. The specific deletion of HIF-1α in photoreceptor cells led to a significant reduction of HIF-1α mRNA and protein levels. Accordingly, HIF-1 target gene expression after hypoxia was significantly diminished. Surprisingly, the strong neuroprotective effect of hypoxic preconditioning persisted in conditional knock out mice showing that HIF-1α is not required to protect photoreceptor cells in an autocrine fashion. Additionally, HIF-1α was not required to endure hypoxic preconditioning per se. Induction of HIF-2α and pSTAT3 in wild type and in knock out mice suggests that these factors might compensate for the lack of HIF-1α and confer photoreceptor resistance to light damage after hypoxic preconditioning. Furthermore, several potentially neuroprotective genes, detected during micro-array analyses of the hypoxic retinal transcriptome, were similarly induced in knock out and control mice after hypoxia. Conclusion: The mechanisms of retinal neuroprotection due to hypoxic preconditioning are largely unknown. The discovery of pathways, transcription factors or specific genes which are required to facilitate retinal neuroprotection should help to understand molecular changes in retinal pathology. Controlling the expression of identified neuroprotective genes or upstream transcription factors, which govern death or survival pathways, provides a possibility to precisely design prospective therapeutic approaches. This study presents an overview of genes, which are differentially regulated in the retina after hypoxia and suggests potential target genes for further investigation. Additionally, we analyzed the role of HIF-1α and it’s involvement in retinal neuroprotection by hypoxic preconditioning. We showed that the photoreceptor cell-specific stabilization of HIF-1α during hypoxic preconditioning is not required to protect these cells against toxic light exposure. Therefore, we discuss the potential role of further transcription factors like HIF-2α and STAT3. ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund: Alters-abhängige Makula Degeneration (AMD) und Retinitis Pigmentosa (RP) sind Netzhauterkrankungen, die durch den Verlust von Photorezeptorzellen zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens bzw. zur vollständigen Blindheit führen. Um die pathologischen Veränderungen in der erkrankten Netzhaut zu simulieren, verwenden wir ein etabliertes Maus-Modell in dem der Zelltod von Photorezeptoren durch Licht induziert wird. Neuroprotektion ist eine Strategie, um die Degeneration von Neuronen zu verzögern oder vollständig zu inhibieren. Dabei hat sich gezeigt, dass hypoxisches Präkonditionieren – also eine zeitlich begrenzte artifizielle Reduktion der Sauerstoff- verfügbarkeit – besonders erfolgreich ist. Die Mechanismen, die zu einer Schutzreaktion in der Netzhaut führen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Allerdings weiss man, dass während der Hypoxie eine Reihe von Transkriptionsfaktoren aktiviert wird die potentielle neuroprotektive Gene differentiell regulieren. Ein solcher Transkriptionsfaktor ist hypoxic-inducible factor 1 (HIF-1), der sehr spezifisch durch einen geringen Sauerstoffgehalt aktiviert wird und die Expression mehrer Gene reguliert. HIF-1 ist ein Heterodimer, dass aus einer kontinuierlich exprimierten HIF-1β Untereinheit und einer Sauerstoff-abhängig regulierten HIF-1α Untereinheit besteht. Bei geringen Sauerstoffkonzentrationen wird die HIF-1α Untereinheit stabilisiert, dimerisiert mit HIF-1β und reguliert die Expression von Genen mit unterschiedlichen zell-biologischen Funktionen, wie z.B. Energiemetabolismus, Entwicklung von Blutgefässen oder die Induktion von Zellprotektion. Einige Studien haben Hinweise geliefert, dass HIF-1α die treibende Kraft der Netzhautprotektion nach hypoxischen Präkonditionieren sein könnte. Jedoch ist ein HIF-1α abhängiger Schutzmechanismus in der Netzhaut noch nicht vollständig bewiesen worden. Daher haben wir untersucht, ob eine Photorezeptor-spezifische Stabiliserung von HIF-1α während der Hypoxie benötigt wird, um die Netzhaut vor einer Licht-induzierten Degeneration zu schützen. Ausserdem, haben wir mit Hilfe von Micro-arrays die globale Genexpression in der Netzhaut nach hypoxischen Präkonditionieren untersucht, um mögliche neuroprotektive Kandidatengene zu indentifizieren.

Ergebnisse: Um die globale Genexpression in der Netzhaut nach hypoxischen Präkonditionieren zu analysieren, haben wir Mäuse einer reduzierten Sauerstoffkonzentration ausgesetzt. Anschliessend haben wir Netzhäute direkt oder 2 Stunden, 4 Stunden und 16 Stunden nach Hypoxie isoliert und die Genexpression mit unbehandelten Kontrolltieren verglichen. Dabei haben wir festgestellt, dass es während der Hypoxie zu einer starken Veränderung der Genexpression in der Netzhaut kommt, die sich jedoch innerhalb von 16 Stunden wieder normalisiert. Die Genexpression von Cyclin-dependent kinase inhibitor 1a (p21), welcher möglicherweise protektive Eigenschaften besitzt, war direkt nach der Hypoxie stark induziert. Um zu überprüfen ob p21 tatsächlich eine Rolle bei der Netzhautprotektion spielen könnte, haben wir hypoxisch präkonditionierte p21 “knock out” Mäuse gegen Licht exponiert. Dabei haben wir festgestellt, dass der Hypoxie-induzierte Schutz der Netzhaut unabhängig von einer p21 Expression funktionieren kann. Durch die funktionelle Gruppierung von differentiell regulierten Genen konnten wir weitere mögliche Kandidaten wie Metallothionein 1/2, Cebpd oder Adrenomedullin identifizieren. Um festzustellen, ob HIF-1α tatsächlich essentiell für die Protektion der Netzhaut ist, haben wir Mäuse mit einem Photorezeptor-spezifischen HIF-1α knock out analysiert. Funktionell führte das sowohl zu einer reduzierten HIF-1α Genexpression in der Retina als auch zu einer reduzierten Proteinakkumulation der HIF-1α Untereinheit unter hypoxischen Bedingungen. Dementsprechend waren nach der Hypoxie auch Gene, die durch HIF-1 reguliert werden, weniger stark induziert. Nachdem wir hypoxisch präkonditionierte HIF-1α knock out Mäuse mit hohen Lichtintensitäten gestresst haben, zeigte sich, dass eine HIF-1α Stabilisierung in Photorezeptoren nicht zwingend notwendig ist, um eine Neuroprotektion zu gewährleisten. Ausserdem war eine Photorezeptor-spezifische HIF-1α Expression nicht erforderlich, um die Netzhaut vor transienter Hypoxie per se zu schützen. Die Induktion von HIF-2α und pSTAT3 in knock out und Kontrollmäusen könnte ein Hinweis darauf sein, dass diese Faktoren den Verlust von HIF-1α kompensieren können und somit die Netzhaut weiterhin gegen Lichtschaden schützen. Zusätzlich haben wir beobachtet, dass potentiell neuroprotektive Gene in HIF-1α knock out Mäusen und in Kontrollmäusen vergleichbar exprimiert wurden. Signifikanz: Die grundlegeneden Mechanismen, welche die Netzhaut durch hypoxisches Präkonditionieren schützen, sind nicht komplett aufgeklärt. Die Identifizerung von Signalwegen, von Transkriptionsfaktoren oder von spezifischen Genen, die für einen Schutz der Netzhaut essentiell sind, könnte ebenfalls Aufschluss über grundlegende pathologische Veränderungen in Modellen für Netzhauterkrankungen geben. Die Kontrolle der Expression von identifizierten Genen bzw. die Kontrolle von Transkriptionsfaktoren mit nachgewiesenen Schutzeigenschaften bietet die Möglichkeit einer therapeutischen Strategie, um Netzhauterkrankung einzuschränken oder zu verhindern. In unserer Studie geben wir einerseits einen generellen Überblick über Gene die durch hypoxisches Präkonditionieren differentiell reguliert werden und haben andererseits spezifische Kandidaten-Gene mit potentiell neuroprotektiven Eigenschaften identifiziert. Nachdem wir mit p21 bereits einen ersten Kandidaten selbst analysiert haben, stellt diese Studie weitere Proteine oder Gene zur detaillierten Analyse zur Verfügung. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Photorezeptor-spezifische Expression von HIF-1α nicht zwingend notwendig ist, um Photorezeptoren gegen toxische Lichtintensitäten zuschützen. In diesem Zusammenhang diskutieren wir die mögliche Beteiligung von anderen Transkriptionsfaktoren wie HIF-2α und pSTAT3.

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Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Neuhauss Stephan, Grimm Christian
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2009
Deposited On:12 Nov 2009 09:11
Last Modified:24 Sep 2019 16:22
Number of Pages:276
Additional Information:Enthält Sonderdrucke
OA Status:Green
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