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The Endoplasmic reticulum and insulin signalling in adipocytes


Xu, Linhua. The Endoplasmic reticulum and insulin signalling in adipocytes. 2010, University of Zurich, Faculty of Science.

Abstract

Upon binding of insulin, the insulin receptor (IR) is activated by phosphorylation on tyrosine residues. This engages insulin receptor substrate (IRS) proteins and transmits the signal downstream via e.g. mitogen-activated protein kinases (MAPK) and protein kinase B (PKB) to evoke context-specific responses like increased glucose uptake into muscle and fat and suppression of hepatic glucose production. Not only insulin sensing but also insulin production in pancreatic β-cells depends on IRS function. Disturbance of IRS signalling can result in diabetes.

Recent findings indicate that obesity-induced endoplasmic reticulum (ER) stress in liver and fat impairs IRS-dependent signalling. The cellular response to ER stress, called unfolded protein response (UPR), activates c-jun N-terminal kinase (JNK) leading to serine phosphorylation and inhibition of IRS1. Furthermore, ER stress can also induce apoptosis in β-cells which underlines the outstanding role of the ER for the proper regulation of blood glucose homeostasis.

Glucose-regulated protein 78 (Grp78/BiP) is a molecular chaperone involved in the folding of nascent polypeptide chains in the ER. It is also an important regulator of the UPR which controls transcription, translation and apoptosis upon ER stress.

Our lab had previously performed yeast 2-hybrid screening with IRS1/2 as bait and isolated several new IRS-binding proteins. Grp78/BiP was one of the candidates. A clone encoding amino acids 336-517 of Grp78/BiP has been isolated in our screen with IRS2 as bait. This fragment interacted with IRS1 and IRS2 in yeast and in extracts from mammalian cells. The regions on IRS1 that are recognized by Grp78/BiP span amino acids 270-517 and 974-1242.

The aim of this thesis was to define possible molecular mechanisms that link the UPR to insulin signalling and thereby contribute to the development of diabetes.

To this end, the role of ER stress in adipocytes and in the development of insulin resistance was studied as well as the role of Grp78/BiP in insulin signal transduction.

It was found that ER stress represses expression/activation of the IR and IRS. However, ER stress did not block insulin-stimulated glucose transport in adipocytes, probably due to reduction of the expression levels of AS160. Further more, lypolysis was reduced under ER stress. The secretion of adipokines from adipocytes was disturbed under ER stress. Pro- inflammatory IL-6 was elevated but leptin and adiponectin were reduced. Conditioned

-1- medium collected from adipocytes under ER stress increased proliferation of INS-1E cells. Ectopic expression of IRS1 or IRS2 counteracted ER stress-induced effects.

Under homeostasis, Grp78/BiP reduced activation of IR and MAPK but induced PKB activation, in both CHO-IR and 3T3-L1 adipocytes. Under ER stress, Grp78/BiP restored PKB activation in 3T3-L1 cells.

The presented work shows that obesity-induced ER stress reduces insulin signalling and alters the secretion of adipokines in adipocytes. The binding between IRS and Grp78/BiP may contribute to these changes. However, the reduction of signalling and the changes in adipokine secretion do appear not to impair insulin action since control over lipolysis and glucose transport was unaffected. ER stress appears to affect systemic regulation of energy homeostasis but does not impair the metabolic function of the individual adipocyte. Importantly, some effects of ER stress might even support maintenance of glucose homeostasis.



-2- ZUSAMMENFASSUNG

Nach Bindung von Insulin wird der Insulin-Rezeptor (IR) durch Phosphorylierung an Tyrosin-Stellen aktiviert. Dies ermöglicht Bindung von Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS)- Proteinen. Die Signalübermittlung aktiviert untergeordnete Kinasen wie z.B. Mitogen- Activated Protein Kinase (MAPK) und Protein Kinase B (PKB) und führt schlussendlich zu Kontext-spezifischen Reaktionen wie beispielsweise vermehrter Glukoseaufnahme in Muskel und Fett sowie Unterdrückung der hepatischen Glukose produktion. IRS Proteine werden nicht nur für die Insulinwirkung gebraucht, sondern auch für die Insulinproduktion in den β- Zellen der Bauchspeicheldrüse. Eine Störung der IRS-Signalübertragung kann Diabetes verursachen.

Neue Erkenntnisse zeigen, dass durch Fettleibigkeit verursachte Störungen im Endoplasmatischen Retikulum (ER, ER Stress) die IRS-abhängige Signalübertragung in der Leber und im Fett beeinträchtigen. Die zelluläre Reaktion auf ER Stress, die UPR (unfolded protein response), aktiviert c-Jun N-terminal kinase (JNK), die durch Serin-Phosphorylierung IRS1 hemmt. Darüber hinaus kann ER Stress auch Apoptose in β-Zellen induzieren, was wiederum die wichtige Rolle des ER für die korrekte Regulierung der Blutzucker-Homöostase unterstreicht.

Glucose-regulated protein 78 (Grp78/BiP) ist ein Chaperon, welches an der Faltung von entstehenden Polypeptidketten im ER beteiligt ist. Es ist ebenfalls ein wichtiger Regulator der UPR, die Transkription, Translation und Apoptose unter ER Stress kontrolliert.

In unserer Gruppe wurden mehrere neue an IRS-bindende Proteine isoliert, darunter Grp78/BiP. Ein entsprechendes Fragment mit den Aminosäuren 336-517 zeigte Wechselwirkung mit IRS1 und IRS2 in Hefe und in Lysaten von Säugerzellen. Als Bindungsstellen für Grp78/BiP auf IRS1 wurden Aminosäuren 270-517 und 974-1242 identifiziert.

Das Ziel dieser Dissertation war es, mögliche molekulare Mechanismen zu definieren, die die UPR und die Insulin-Signalübertragung verbinden und somit zur Entwicklung von Diabetes beitragen könnten.

Zu diesem Zweck wurde untersucht welche Rolle ER Stress und die UPR in Adipozyten spielen und ob die Entwicklung der Insulin-Resistenz von Grp78/BiP and dessen Interaktion mit IRS abhängen könnte.

-3- Es wurde festgestellt, dass ER Stress die Expression/Aktivierung des IR und die von IRS Proteinen unterdrückt. Allerdings blockierte ER Stress durch Insulin stimulierten Glukose- Transport in Fettzellen nicht, wahrscheinlich wegen der Reduktion der Expression von AS160. Ferner war die Lypolyse unter ER Stress reduziert und die Sekretion von Adipokinen durch Fettzellen gestört. Entzündungsfördernde Faktoren wie beispielsweise IL-6 waren erhöht, hingegen waren Leptin und Adiponektin reduziert. Konditioniertes Medium, welches von Adipozyten nach ER Stress-Induktion gesammelt wurde, bewirkte eine starke Proliferation in INS-1 Zellen. Ektopische Expression von IRS1 oder IRS2 wirkte vielen ER Stress-induzierten Effekten entgegen.

Grp78/BiP reduzierte unter Homöostase die Insulinabhängige Aktivierung des IR und der MAPK, aber induzierte die Aktivierung von PKB in CHO-IR Zellen und 3T3-L1 Adipozyten. Unter ER Stress wirkte Grp78/BiP der Reprimierung von PKB in 3T3-L1 Zellen entgegen.

Die vorgestellte Arbeit zeigt, dass durch Fettleibigkeit induzierter ER Stress die Insulin- Signalübertragung hemmt und die Sekretion von Adipokinen in Adipozyten verändert. Die Bindung zwischen IRS und Grp78/BiP könnte zu diesen Veränderungen beitragen. Allerdings scheinen die Hemmung der Signalübertragung und die Veränderungen der Adipokin- Sekretion die Insulin-Wirkung in Fettzellen nicht zu beeinträchtigen, da die Kontrolle über die Lipolyse und der Glucose-Transport unbeeinflusst blieben. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass ER Stress vielmehr die systemische Regulierung der Glukose-Homestase beeinflusst als die einzelnen Adipocyten. Wichtig ist, dass einige Auswirkungen des ER Stresses sogar die Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase unterstützen konnten.



-4-

Abstract

Upon binding of insulin, the insulin receptor (IR) is activated by phosphorylation on tyrosine residues. This engages insulin receptor substrate (IRS) proteins and transmits the signal downstream via e.g. mitogen-activated protein kinases (MAPK) and protein kinase B (PKB) to evoke context-specific responses like increased glucose uptake into muscle and fat and suppression of hepatic glucose production. Not only insulin sensing but also insulin production in pancreatic β-cells depends on IRS function. Disturbance of IRS signalling can result in diabetes.

Recent findings indicate that obesity-induced endoplasmic reticulum (ER) stress in liver and fat impairs IRS-dependent signalling. The cellular response to ER stress, called unfolded protein response (UPR), activates c-jun N-terminal kinase (JNK) leading to serine phosphorylation and inhibition of IRS1. Furthermore, ER stress can also induce apoptosis in β-cells which underlines the outstanding role of the ER for the proper regulation of blood glucose homeostasis.

Glucose-regulated protein 78 (Grp78/BiP) is a molecular chaperone involved in the folding of nascent polypeptide chains in the ER. It is also an important regulator of the UPR which controls transcription, translation and apoptosis upon ER stress.

Our lab had previously performed yeast 2-hybrid screening with IRS1/2 as bait and isolated several new IRS-binding proteins. Grp78/BiP was one of the candidates. A clone encoding amino acids 336-517 of Grp78/BiP has been isolated in our screen with IRS2 as bait. This fragment interacted with IRS1 and IRS2 in yeast and in extracts from mammalian cells. The regions on IRS1 that are recognized by Grp78/BiP span amino acids 270-517 and 974-1242.

The aim of this thesis was to define possible molecular mechanisms that link the UPR to insulin signalling and thereby contribute to the development of diabetes.

To this end, the role of ER stress in adipocytes and in the development of insulin resistance was studied as well as the role of Grp78/BiP in insulin signal transduction.

It was found that ER stress represses expression/activation of the IR and IRS. However, ER stress did not block insulin-stimulated glucose transport in adipocytes, probably due to reduction of the expression levels of AS160. Further more, lypolysis was reduced under ER stress. The secretion of adipokines from adipocytes was disturbed under ER stress. Pro- inflammatory IL-6 was elevated but leptin and adiponectin were reduced. Conditioned

-1- medium collected from adipocytes under ER stress increased proliferation of INS-1E cells. Ectopic expression of IRS1 or IRS2 counteracted ER stress-induced effects.

Under homeostasis, Grp78/BiP reduced activation of IR and MAPK but induced PKB activation, in both CHO-IR and 3T3-L1 adipocytes. Under ER stress, Grp78/BiP restored PKB activation in 3T3-L1 cells.

The presented work shows that obesity-induced ER stress reduces insulin signalling and alters the secretion of adipokines in adipocytes. The binding between IRS and Grp78/BiP may contribute to these changes. However, the reduction of signalling and the changes in adipokine secretion do appear not to impair insulin action since control over lipolysis and glucose transport was unaffected. ER stress appears to affect systemic regulation of energy homeostasis but does not impair the metabolic function of the individual adipocyte. Importantly, some effects of ER stress might even support maintenance of glucose homeostasis.



-2- ZUSAMMENFASSUNG

Nach Bindung von Insulin wird der Insulin-Rezeptor (IR) durch Phosphorylierung an Tyrosin-Stellen aktiviert. Dies ermöglicht Bindung von Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS)- Proteinen. Die Signalübermittlung aktiviert untergeordnete Kinasen wie z.B. Mitogen- Activated Protein Kinase (MAPK) und Protein Kinase B (PKB) und führt schlussendlich zu Kontext-spezifischen Reaktionen wie beispielsweise vermehrter Glukoseaufnahme in Muskel und Fett sowie Unterdrückung der hepatischen Glukose produktion. IRS Proteine werden nicht nur für die Insulinwirkung gebraucht, sondern auch für die Insulinproduktion in den β- Zellen der Bauchspeicheldrüse. Eine Störung der IRS-Signalübertragung kann Diabetes verursachen.

Neue Erkenntnisse zeigen, dass durch Fettleibigkeit verursachte Störungen im Endoplasmatischen Retikulum (ER, ER Stress) die IRS-abhängige Signalübertragung in der Leber und im Fett beeinträchtigen. Die zelluläre Reaktion auf ER Stress, die UPR (unfolded protein response), aktiviert c-Jun N-terminal kinase (JNK), die durch Serin-Phosphorylierung IRS1 hemmt. Darüber hinaus kann ER Stress auch Apoptose in β-Zellen induzieren, was wiederum die wichtige Rolle des ER für die korrekte Regulierung der Blutzucker-Homöostase unterstreicht.

Glucose-regulated protein 78 (Grp78/BiP) ist ein Chaperon, welches an der Faltung von entstehenden Polypeptidketten im ER beteiligt ist. Es ist ebenfalls ein wichtiger Regulator der UPR, die Transkription, Translation und Apoptose unter ER Stress kontrolliert.

In unserer Gruppe wurden mehrere neue an IRS-bindende Proteine isoliert, darunter Grp78/BiP. Ein entsprechendes Fragment mit den Aminosäuren 336-517 zeigte Wechselwirkung mit IRS1 und IRS2 in Hefe und in Lysaten von Säugerzellen. Als Bindungsstellen für Grp78/BiP auf IRS1 wurden Aminosäuren 270-517 und 974-1242 identifiziert.

Das Ziel dieser Dissertation war es, mögliche molekulare Mechanismen zu definieren, die die UPR und die Insulin-Signalübertragung verbinden und somit zur Entwicklung von Diabetes beitragen könnten.

Zu diesem Zweck wurde untersucht welche Rolle ER Stress und die UPR in Adipozyten spielen und ob die Entwicklung der Insulin-Resistenz von Grp78/BiP and dessen Interaktion mit IRS abhängen könnte.

-3- Es wurde festgestellt, dass ER Stress die Expression/Aktivierung des IR und die von IRS Proteinen unterdrückt. Allerdings blockierte ER Stress durch Insulin stimulierten Glukose- Transport in Fettzellen nicht, wahrscheinlich wegen der Reduktion der Expression von AS160. Ferner war die Lypolyse unter ER Stress reduziert und die Sekretion von Adipokinen durch Fettzellen gestört. Entzündungsfördernde Faktoren wie beispielsweise IL-6 waren erhöht, hingegen waren Leptin und Adiponektin reduziert. Konditioniertes Medium, welches von Adipozyten nach ER Stress-Induktion gesammelt wurde, bewirkte eine starke Proliferation in INS-1 Zellen. Ektopische Expression von IRS1 oder IRS2 wirkte vielen ER Stress-induzierten Effekten entgegen.

Grp78/BiP reduzierte unter Homöostase die Insulinabhängige Aktivierung des IR und der MAPK, aber induzierte die Aktivierung von PKB in CHO-IR Zellen und 3T3-L1 Adipozyten. Unter ER Stress wirkte Grp78/BiP der Reprimierung von PKB in 3T3-L1 Zellen entgegen.

Die vorgestellte Arbeit zeigt, dass durch Fettleibigkeit induzierter ER Stress die Insulin- Signalübertragung hemmt und die Sekretion von Adipokinen in Adipozyten verändert. Die Bindung zwischen IRS und Grp78/BiP könnte zu diesen Veränderungen beitragen. Allerdings scheinen die Hemmung der Signalübertragung und die Veränderungen der Adipokin- Sekretion die Insulin-Wirkung in Fettzellen nicht zu beeinträchtigen, da die Kontrolle über die Lipolyse und der Glucose-Transport unbeeinflusst blieben. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass ER Stress vielmehr die systemische Regulierung der Glukose-Homestase beeinflusst als die einzelnen Adipocyten. Wichtig ist, dass einige Auswirkungen des ER Stresses sogar die Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase unterstützen konnten.



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Additional indexing

Item Type:Dissertation (monographical)
Referees:Hennet Thierry, Niessen Markus
Communities & Collections:UZH Dissertations
Dewey Decimal Classification:610 Medicine & health
Language:English
Place of Publication:Zürich
Date:2010
Deposited On:17 May 2010 16:18
Last Modified:24 Sep 2019 16:51
Number of Pages:117
Additional Information:The Endoplasmic reticulum and insulin signalling in adipocytes / vorgelegt von Linhua Xu. - Zürich, 2010
OA Status:Green
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